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產(chǎn)物純化清除內(nèi)毒素

發(fā)布時間: 2023-09-01  點擊次數(shù): 768次

產(chǎn)物的純化可以有效地去除內(nèi)毒素﹐常用的純化流程由幾個層析步驟組成,包括離子交換、疏水相互作用層析和凝膠過濾色譜法。一般來說,起初,高內(nèi)毒素含量的產(chǎn)物通過上述過程的純化而不再經(jīng)別的特殊處理就能將內(nèi)毒素減少至100EU/ml左右,甚至更低。如重組α1-抗-胰-蛋-白-酶在粗制的細胞勻漿中濃度為1.2×107EU/ml,當采用超濾﹑離子交換和固定的金屬螯合物吸附層析法三步純化后,終產(chǎn)物中的內(nèi)毒素含量小于0.22 EU/ml。

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另外,雖然有幾種吸附步驟的混合使用,但在最終產(chǎn)物中仍有相當量的內(nèi)毒素未能被清除。雖然在通過陽離子交換和肝素吸附劑等無菌層析后,蛋白質(zhì)的純化度可達到99%以上,但是最終產(chǎn)物中的內(nèi)毒素含量仍有14EU/ml。再如,在純化的鼠IgG1預備物(PI=5.5)中微生物污染是很少的,經(jīng)過立即無菌過濾后,內(nèi)毒素和 IgG1分別為100EU/ml3EU/ml。此時再用其他方法(包括離子交換、疏水相互作用和蛋白質(zhì)A親和層析)再處理此IgG1溶液并未能進一步去除所含的內(nèi)毒素。同樣,當多黏菌素B或組胺酸用作層析柱時,在大劑量的樣品情況下,不能有效地將內(nèi)毒素減少到一個理想的限度以下。而在處理少量的樣品時則可以一定程度地減少內(nèi)毒素,但問題是會丟失相對大量的產(chǎn)物。

蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素分子的特性對于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的進一步減少有獨-特的影響。如針對堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)的內(nèi)毒素選擇性吸附劑是以聚乙胺葡聚糖為基礎(chǔ)的,能成功地在負性層析模型中進行。當內(nèi)毒素被吸附的同時,bFGF的殘留可以避免。對IgG1來說,只有特殊的內(nèi)毒素選擇性吸附劑是成功的。

在制藥工業(yè)上有一些可選擇的方法可以得到低內(nèi)毒素含量的產(chǎn)物,這些方法之間的差異表現(xiàn)在內(nèi)毒素清除時魚和熊掌不能兼得的問題。因為藥用性蛋白質(zhì)的酸堿性不同,在制造過程中需要的合適環(huán)境也不同,所以不能采用完-全相同的方法來去除其中的內(nèi)毒素。例如,離子交換層析對尿-激-酶或bFGF等堿性蛋白質(zhì)的去污染有用,而對酸性蛋白質(zhì)則因為吸附因素的作用將會同時伴有產(chǎn)物的丟失。小分子蛋白質(zhì)如肌球蛋白(相對分子質(zhì)量為18000)可用于超濾法去除大的內(nèi)毒素聚合物,而對大分子蛋白質(zhì)如免疫球蛋白(相對分子質(zhì)量為150000)來說,超濾則不起作用。此外,如果內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)的相互作用使內(nèi)毒素單體通過細胞膜滲透到蛋白質(zhì)中,則此時超濾也是無效的。

由于產(chǎn)物多種多樣,人們期望用一個統(tǒng)一適用的內(nèi)毒素清除方法是不切實際的。另一方面,由于所采用技術(shù)的不同也說明,在純化步驟的改進時,內(nèi)毒素分子的特殊性質(zhì)并不總是被完-全考慮到的。



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